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广州竞远生物科技有限公司 
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| 分子水平实验（4） |
甲基化检测服务
实验原理
DNA甲基化是最早发现的基因表观修饰方式之一，真核生物中的甲基化仅发生于胞嘧啶，即在DNA甲基化转移酶( DNMTS)的作用下使CpG二核苷酸5～端的胞喀啶转变为5”-甲基胞喀啶。DNA甲基化通常抑制基因表达，去甲基化则诱导了基因的重新活化和表达。这种DNA修饰方式在不改变基因序列前提下实现对基因表达的调控。
注:M:甲基化引物PCR扩増;U:非甲基化引物PCR扩増。SW1353细胞在药物处理后从完全甲基化转变为完全非甲基化，OUMS-27细胞在5-Aza-dC处理后从部分甲基化部分非甲基化状态转变为完全非甲基化。
Northern或 Southern Blot检测服务
实验原理
Southern杂交是进行基因组DNA特定序列定位的方法，由 Southern于1975年创建，称为 Southerne印迹技术。其原理为利用琼脂糖凝胶电泳分离经限制性内切酶消化的DNA片段，将胶上的DNA变性并在原位将单链DNA片段转移至尼龙膜或其他固相支持物上，经干烤或者紫外线照射固定，再与相对应结构的DG标记探针进行杂交，用放射自显影或酶反应显色，从而检测特定DNA分子的含量。
Northerne印迹杂交( Northern blot)是一种将RNA从琼脂糖凝胶中转印到硝酸纤维素膜上的方法，主要利用碱基配对原则，利用特性的DNA探针与其杂交，经过显影技术分析RNA的最和大小。RNA印迹技术正好与DNA相对应，故被称为 Northern印迹杂交，与此原理相似的蛋白质印迹技术则被称为 Western blot
实验流程
a) Northern Blot
1.完整mRNA的分离
2.根据RNA的大小通过琼脂糖凝胶电泳对RNA进行分离
3.将RNA转移到固相支持物上，在转移的过程中，要保持RNA在凝胶中的相对分布
4.将RNA固定到支持物上
5.固相RNA与探针分子杂交
6.除去非特异结合到固相支持物上的探针分子
7.对特异结合的探针分子的图像进行检测、捕获和分析
b）Southern Blot
1、制备待测DNA2、DNA限制酶消化
3、琼脂糖凝胶电泳分离待测DNA样品
4、电泳凝胶预处理
5、转膜
6、探针标记
7、预杂交
8、 Southern杂交
9、洗膜
10、放射性自显影检测
11、实验结果分析及报告
样本要求
1.新鲜组织:
用解剖刀等迅速切成小碎块约30-100mg，放入20mL离心营中开盖液氮速东15min.80度保存，干冰运输。每个northern blot泳道提供2-3管样品。注:解剖刀处理组织的时间尽量控制在1min以内。液氮速冻时必须开盖以防炸裂。
2细胞样品:
县浮细胞1000-1500rpm，5min，常温离心收集细胞。贴壁细胞用胰蛋白酶消化后吹丁收集，PBS洗涤细胞，去除多余培养基和胰蛋白酶。开盖液氮速冻15min，-80度保存干冰运输，一般情况下，细胞培养的6孔板每孔细 |
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